基因治疗载体AAV与固有免疫应答
重组腺相关病毒（rAAV）被认为是基因治疗领域最有前景的基因载体。2012-2019年，相继有三款rAAV为载体的基因治疗药物分别被欧洲药品管理局和美国FDA批准上市。然而，在一些动物试验和临床试验中，研究者们发现rAAV载体可以诱导宿主产生免疫反应，从而影响转基因的长期有效表达，甚至产生免疫毒性反应。本文将着重介绍rAAV引起的固有免疫反应，以及采取哪些策略可以降低或避免这些反应的发生。
图1. PRRs对AAV的识别
1. 模式识别受体
固有免疫反应是宿主通过模式识别受体（PRR）识别病原体的独特结构基序——病原相关分子模式（PAMP），进而诱发一系列的信号级联反应产生的。PRR通常在巨噬细胞和树突细胞（DC）等固有免疫细胞上高水平表达，它们可以识别病毒核酸和膜表面糖蛋白成分。根据蛋白质域的同源性，PRR有Toll样受体（TLRs）、cGAS、NOD样受体（NLRs）、C型凝集素受体（CLR）、黑色素瘤缺乏因子2 样受体（ALR）和RIG-1样受体（RLR）等几大类。根据它们的定位，PRR 还可以分为两大类：膜结合受体（如 TLR）和细胞内受体（如 ALR、NLR 和 cGAS）。本文将着重介绍膜结合受体中的Toll样受体和细胞内受体如何识别rAAV感染。
1.1. Toll样受体
Toll样受体（TLRs）是目前研究最广泛的PRR。它是一种跨膜蛋白，包含与PAMP结合的胞外区，以及胞内Toll/IL-1R同源区（TIR）。其中，TLR2 （糖蛋白和脂蛋白）、TLR3 （dsRNA）、TLR4 （糖蛋白和细菌LPS）、TLR7 （ssRNA）、TLR8 （ssRNA）和TLR9 （CpG DNA）被认为与病毒引起的炎症反应相关。
TLR9 可以与存在于细菌和 DNA 病毒基因组中的未甲基化的 CpG序列特异性结合，此过程可能发生在内体运输期间，或者在溶酶体中病毒衣壳发生降解而将基因组暴露时，CpG序列与TLR9结合后活化MyD88分子，进而激活 NF-κB 和干扰素调节因子（IRF7）并诱导 I 型 IFN 和 干扰素刺激基因（ISG）的表达。研究发现，rAAV 在野生型小鼠体内递送的转基因表达会被抑制，但在 TLR9 基因敲除动物中没有。此外，rAAV携带未经修饰的转基因在体内30 天后表达丢失，而当转基因中的CpG被改造时，表达时长超过了90天。
此外，值得注意的是，虽然自互补AAV（scAAV）载体递送转基因的表达更快速且高效，但研究发现它比单链载体（ssAAV）引起了更强的固有免疫反应。通常情况下，针对单链载体的免疫反应是快速且瞬时的。注射后2h内，I型IFN、TLR9、MyD88和TNF-α的RNA水平会小幅度提高，而在6h内消失。相反的，scAAV会诱导这些基因更高水平的表达，同时IL-6、CCL5、MIP-1和TLR2的表达也会升高。细胞因子反应随scAAV载体的剂量变化而变化，而与ssAAV的剂量无关。ScAAV诱导的促炎细胞因子的表达完全依赖于TLR9。将scAAV注射TLR9−/−小鼠则完全没有检测到上述基因RNA转录明显上调，只有TLR2的微弱增加。同样的现象也发生在使用寡脱氧核苷酸（ODN）时，这些分子能够与TLR9强结合且不诱导信号传导，可以用作TLR9的信号阻断剂。当scAAV注射小鼠的同时施用ODN抑制剂，细胞因子反应的抑制效应与TLR9敲除小鼠相似。此外，它还能抑制巨噬细胞、NK细胞和中性粒细胞的浸润，说明这些细胞的招募依赖于TLR9信号诱导的趋化因子。
毫无意外，ssAAV和scAAV在固有免疫和获得性免疫中的差异存在相关性。在相同的剂量下，scAAV比ssAAV诱导了更强的CD8+ T和抗体反应。当注射TLR9−/−小鼠或联合注射ODN抑制剂时，TLR9信号的阻断引起了CTL反应的显著降低，同时，延缓了anti-AAV抗体的生成。这说明，scAAV引起的获得性免疫增强与固有免疫类似，都依赖于TLR9信号。然而，当采用肝脏直接递送FIX时发现，ssAAV和scAAV诱导的适应性免疫反应没有差异，可能与固有免疫信号与转基因表达的时间间隔有关。ScAAV诱导的促炎细胞因子反应主要发生在载体注射后的9h内，而转基因只有在病毒脱衣壳和转录激活后表达，二者存在时间差。与肝脏基因转移相比，骨骼肌内注射scAAV载体能引起对转基因产物的强烈反应。虽然scAAV肝脏基因递送后没有引起抗转基因反应，但抑制TLR9信号能够增强系统性的FIX表达。这意味着NK细胞或者IFN-I活性可能影响了动物模型体内AAV介导的转基因表达的整体水平。
表 1 总结了几种克服 TLR 信号传导的策略。如上所述，通过改造修饰载体基因组中的 CpG来阻止 TLR9 信号传导已被证明可以增强转基因表达并减少肌肉中效应 T 细胞的浸润。
表1. 克服PRR免疫识别的策略
1.2. 胞内受体
包括识别DNA的cGAS、干扰素诱导蛋白 16（IFI16）和 AIM2，以及识别RNA的RIG-I 样受体（RLR）等。AAV 基因组中含有可能激活细胞质内DNA 识别受体的元件，例如 ITR 发夹结构。具体的激活机制尚不完全清楚，一种假设是衣壳被蛋白酶体降解暴露了 AAV 基因组。另一种可能性是 AAV 感染使得细胞将线粒体 DNA 释放到细胞质中，然后激活细胞质内的受体。克服细胞质 DNA受体识别的策略尚未得到深入探索，因为它们在限制 rAAV 功效方面的作用尚不明确。
细胞溶质 RIG-I 样受体 （RLR） 在几乎所有哺乳动物细胞类型中都有表达，它主要识别异源RNA，该家族的成员包括RIG-I、MDA5 和 LGP2。AAV ITR 具有固有的启动子活性，因此，rAAV 基因组中 5'- 和 3'-ITR 的存在可能导致有义和反义 RNA 的产生，它们可以在细胞质中形成 dsRNA 中间体，这些 dsRNA 分子受到 MDA5 和 RIG-I 的识别，导致产生 IFN-β。在长期 AAV 转导后，还发现 RIG-I 和 MDA5 在灵长类动物视网膜中上调表达。与其他胞内受体一样，RLR 对 rAAV 的影响仍在研究中。在研究丙型肝炎病毒、仙台病毒和 HSV1的感染时发现，它们能够通过增加肝硒蛋白、RNA 解旋酶 SKIV2L 或长链非编码 RNA lncATV 等因子的表达，抑制 RIG-I 的激活。或许阻断AAV中dsRNA引起的免疫反应可以从这些病毒抑制 RLR 激活方法中受到启发。
2. 衣壳免疫和补体系统
图2. AAVs激活补体
尽管衣壳的改变不会影响TLR9相关的固有免疫反应，但是大量的研究证明了针对不同AAV衣壳引起的多种免疫反应。某些特定的AAV亚型，比如AAV1能够转导DC细胞。转导和成熟后的DC细胞将会激活对外源转基因产物的免疫反应。再比如，从恒河猴体内分离出来的AAVrh32.33，用它注射骨骼肌，与AAV8相比，转基因表达水平更低，而抗载体和抗转基因的CD8+T细胞反应更强。这种增强效应依赖于CD4+辅助T细胞，同时与CD40L和CD28共刺激分子有关。
病毒衣壳和补体的相互作用与AAV固有免疫反应有关。免疫沉淀反应显示iC3b可以与AAV衣壳结合，并且，补体与AAV2的结合可以增加巨噬细胞对衣壳的摄取以及合成促炎性细胞因子。补体受体1/2或C3缺陷小鼠与野生型小鼠相比，AAV诱导产生更低的体液免疫水平。此外，AAV不能够激活补体旁路途径。衣壳与H因子结合，抑制因子I介导C3b 降解为 iC3b，这一过程为病毒提供了针对补体的保护效应（图2）。有趣的是，较高剂量的 AAV 可以显著激活补体超过基线水平，而EGTA 可以通过螯合 Ca2+阻断这种反应。这一发现表明 AAV 对补体的激活可能主要依赖于抗体。在人类杜氏肌营养不良症的临床试验中也证明了AAV 激活了补体。一些在试验中接受高剂量rAAV注射的患者体内发现了补体系统的激活，这些患者出现了短暂和/或急性肾功能损害（ClinicalTrials.gov：NCT03362502 和 NCT03368742）。
3. 固有免疫的细胞类型
图3. APC 介导的针对 AAV 载体的免疫反应。A, rAAV 激活 DC 的机制；B, APC 对 rAAV 特异性抗原的呈递。
对 AAV 诱导固有免疫反应的细胞类型的文献报道有限。众所周知，像 cGAS 这样的 PRR 在所有细胞类型中都表达，但在专职抗原呈递细胞 （APC） 中特别丰富。TLR9主要表达于人类的 B 细胞和浆细胞样 DC （pDC）中。专职APC 在 MHC I 类分子介导的AAV 衣壳或转基因抗原呈递中具有重要作用。研究发现，pDCs 和 cDCs 在呈递rAAV时需要协同作用。首先，pDCs 通过 TLR9识别rAAV的核酸并产生大量 IFN-I，以此作为 cDCs 的激活信号，这一过程被称为“DC许可”，cDC细胞对病毒颗粒摄取和加工，然后呈递 AAV 衣壳蛋白启动CD8+ T 细胞的反应（图 3A）。此外，衣壳肽可以通过加载到 MHC II 类分子被呈递给 CD4+ T 细胞（图 3B）。当接受 FIX 基因治疗（rAAV8-FIX） 的患者表现出初始时FIX水平的下降，随后在使用类固醇后又升高时，就发现了这一现象。研究表明，AAV转导肝脏细胞是一种衣壳特异性的CTL反应，衣壳特异性抗原提呈到靶细胞的水平决定了CTL反应的水平。
表2中列出了多种抑制免疫细胞活化的策略。比如，使用细胞类型特异性启动子和 miRNA 介导的脱靶。然而，用于肌肉细胞中特异性表达的启动子在使用时发现在 DC 中存在泄漏表达。另外，在转基因的 3'-UTR 中掺入 miR-142 结合位点，抑制转基因在APCs 的表达从而抑制 CD8+ T 细胞活化。
表2. 针对免疫细胞机制的策略
4. 总结
本文讨论了固有免疫对rAAV 作为基因治疗药物产生的不良影响。尽管安全性是所有基因疗法的主要目标，但这些疗法也可能是诸多罕见病和慢性遗传疾病的唯一治疗选择。因此，这些药物的开发需要我们考虑在挽救生命和相关风险之间取得平衡。在未来的研究中还需要进一步阐明 AAV 引发的固有免疫反应的复杂机制。我们对细节掌握的越多，用于指导改进 AAV 基因治疗的策略就越多。
2.Rogers GL, Martino AT, Aslanidi GV, Jayandharan GR, Srivastava A, Herzog RW. Innate Immune Responses to AAV Vectors. Front Microbiol. 2011 Sep 19;2:194. doi: 10.3389/fmicb.2011.00194.
来源：基因治疗前研社
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